经过亚硫酸氢液处理的杂交捕获的测序数据的全面分析
来源:互联网 发布:java内存模型面试回答 编辑:程序博客网 时间:2024/04/28 12:18
Global analysis of DNA methylation in hepatocellular carcinoma by a liquid hybridization capture-based bisulfite sequencing approach
研究对象:人
期刊:CLINICAL EPIGENETICS
发表时间:2015年
摘要
Epigenetic alterations, such as aberrant DNA methylation of promoter and enhancer regions, which lead to atypical gene expression, have been associated with carcinogenesis. In hepatocellular carcinoma (HCC), genome-wide analysis of methylation has only recently been used. For a better understanding of hepatocarcinogenesis, we applied an even higher resolution analysis of the promoter methylome to identify previously unknown regions and genes differentially methylated in HCC. Optimized liquid hybridization capture-based bisulfite sequencing (LHC-BS) was developed to quantitatively analyze 1.86 million CpG sites in individual samples from eight pairs of HCC and adjacent tissues. By linking the differentially methylated regions (DMRs) in promoters to the differentially expressed genes (DEGs), we identified 12 DMR-associated genes. We further utilized Illumina MiSeq combining the bisulfite sequencing PCR approach to validate the 12 candidate genes. Analysis of an additional 78 HCC pairs on the Illumina MiSeq platform confirmed that 7 genes showed either promoter hyper-methylation (SMAD6, IFITM1, LRRC4, CHST4, and TBX15) or hypo-methylation (CCL20 and NQO1) in HCC. Novel methylome profiling provides a cost-efficient approach to identifying candidate genes in human HCC that may contribute to hepatocarcinogenesis. Our work provides further information critical for understanding the epigenetic processes underlying tumorigenesis and development of HCC.
关键词
DNA甲基化;基于杂交捕获的重亚硫酸盐测序;肝癌细胞
研究背景
肝癌细胞是一种全球流行的负担,与肝癌相关的风险因素包括慢性乙型肝炎,肝炎病毒,丙型肝炎病毒和有毒的代谢相关的几种条件。肝癌的发展是一个多步骤的过程,其特征是基因突变的积累和遗传畸变。表观遗传改变,如异常甲基化和组蛋白修饰比基因突变在癌症发生更频繁,可以显著影响信使RNA信使RNA)合成的功效不改变DNA序列。鉴定DNA甲基化的鲜明特征在疾病的早期诊断和治疗方案的进一步发展方面具有很大的潜力。
研究结果
1.在肝癌细胞中,基因启动子区域失去或者是获得DNA甲基化时,会显示出不同的CPG 岛。
在8对肝癌样本和相邻的肿瘤样本中,启动子附近甲基化的层次聚类分析图
图A,利用Pvlust算法得出的启动子附近的DNA甲基化水平的聚类图,图B,在甲基化水平最高的前100个CPGLs中的基于卡方分析P值的聚类分析图。
2.在78对癌细胞中,利用MiSeq-BSP选择候选基因的甲基化来进行验证
对12个基因甲基化改变的反复验证。图a,表示的是在78对肝癌细胞和非肝癌细胞的样本中的12个基因甲基化的小提琴图。不同的甲基化差异使用T检验。图b,在78个癌症组织样本和非癌症组织样本中的12个基因甲基化改变的分布图,四类肝癌细胞和非肝癌细胞的甲基化显示。图c,在78对肝癌和非肝癌样本中的七个验证基因的主成分分析。图d,78对肝癌样本中7个基因的主成分分析。
3.候选验证基因在肝癌细胞中的表达
上图表示的是候选基因在肝癌组织中的表达改变。图A,在肝癌和非肝癌细胞中,DMR中的五个外显子位点和两个SMAD6启动子位点的甲基化水平展示。图B,用于启动子中的8对肝癌细胞核非肝癌细胞中的2个SMAD6的RT-PCR结果。图c,通过免疫印迹分析,所有8对肝癌样本的候选基因的蛋白质表达,候选基因包括:IFITM1,CHST4,TBX15。图d,相对于肌动蛋白,IFITM1,CHST4,TBX15的蛋白质表达水平的图形描述。
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