Nature：拟南芥微生物组功能研究3人工重组微生物群落

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背景介绍

Bai, Y., et al. (2015). “Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota.” Nature 528(7582): 364-369.

本文是2015末发表在Nature的Article文章，第一作者为白洋，主要负责拟南芥根相关菌分离、培养、测序和人工重组实验，现中科院遗传发育所研究员；共一的第四作者Ruben Garrido-Oter，主要负责细菌鉴定、基因组和扩增子分析，现马普植物育种所Group Leader。通讯作者分别为德国马普植物育种所的Paul Schulze-Lefert教授和瑞士苏黎士微生物所的Julia A. Vorholt教授。

由于本文内容极多，分为四篇文章进行介绍：
- 0概述
- 1细菌分离培养鉴定
- 2细菌基因组测序和分析
- 3人工重组微生物群落

本文是此系列的最后一篇：3人工重组微生物群落

人工重组细菌群落

本研究并不是关注差异丰度菌的具体功能，更多关注人工重组细菌群落的不同来源、不同组合方式、不同接种方式下细菌群落重新定殖后形成的结果。对所有的人工重组菌群研究，均有一定的示范和指导意义。

主要采用叶、根和土壤来源分离的纯菌，组成人工重组微生物群落对拟南芥进行再定殖。研究中采用的培养基质是一种钙化土(Calcined clay)，是用于铺棒球场的材料。

无菌体系培养基质的选择？
在目前来看，无菌小鼠的研究已经非常多植物不动，应该更好培养才对呀，但无菌植物的报导却非常少。这主要包括两方面原因，第一是植物研究确实落后于动物研究；其次是植物生活在土中里面全是微生物。
大家都想到了给土壤灭菌，但末发表的结果表明，不论是高温灭菌，还是辐射灭菌；土壤都不再适合植物生长了，估计是发生了化学变化，产生了不利于植物生长的毒素。这种现象有点像过火的森林，或核爆后的土地，是需要时间进行修复，才能再生长植物的。

另一种方法是在MS固体培养基中生长，确实可行，但存在两方面问题：理化性质和结构与土壤差别实在太大；有种植成功者也表示拟南芥结实困难(可能是湿度过大？)。

本研究使用的钙化土灭菌后无负作用，拟南芥可健康生长。另一个有报导无菌植物的组是Sheng Yang He’s lab (http://www.thehelab.org/)，还没有发表文章，但主页上有介绍相关研究方向，和相关会议的Poster，可以自己去看看。

实验的具体操作步骤

原文为方法部分“Recolonization experiments of leaf-, root- and soil-derived bacteria on
Arabidopsis”。我简要的翻译如下：

实验方法：
- 钙化土用水洗干净，并用高压蒸汽灭菌两次，并在烘箱中彻底干燥(注意用牛皮纸密封保持无菌)；
- 拟南芥种子表面乙醇消毒，并4摄氏度过夜春化；
- 叶、根和土中分离的菌，采用96深孔培养板摇菌，并随后用等体积，或非等体积方式混合，用于构建人工合成的细菌群体(bacterial communities, SynComs), 用于后续实验的接种。
- 混合菌液调成OD600为0.5时，浓度大约为2.75x10^8个细胞/mL；根据实验设计取1 ml菌液，添加至70ml 1/2 MS培养基(pH7，包含维生素但不加糖)，并与100克钙化土在组培瓶(Magenta box)中混匀，这时每克土含有2.75x10^6个细菌，然后直接种植拟南芥种子；
- 植物生长在22摄氏度，11小时光照，54%的温度。
- 7周后，植物根匀浆的细菌浓度达1.4x10^8个细胞每克根组织。
- 采用叶表喷施接种的植物，上述混菌的浓度调为OD600条件下0.2值，并再稀释10倍后，在植物4周时，取170 ul使用TLC层析试剂喷雾器，喷施每个组培瓶。每次喷施的量可以通过向50 ml管中反复喷后称重计算；
- 所有无苗的对照，也进行同样操作，并在7周后无菌环境下取样。
- 样品收获时，无菌环境下使用无菌镊子和剪刀取叶和根，防止交叉污染；凡接触土的叶子要去除；
- 每盒中的地上和地下分别保存于MP的取样管中，用于接下来的提取DNA；

人工重组微生物群落的Beta多样性分析

Extended Data Figure 8 | 箱线图展示无菌拟南芥人工重组群落实验结果的Beta多样性。图中展示不同组内或组间的距离，可以看到在植物的根、叶和土壤中形成的群落与接种时有非常大的变化(a)；而且形成的根、叶和土间也存在极大的差别(b)；采用喷施接种也得到同样的结果(c/d)。

人工重组微生物群落与自然群体丰度比较

Extended Data Figure 9 | 箱线图展示无菌拟南芥人工重组群落在根和叶中门、目和科水平上主要分类级别的丰度差别。我理解为人工重组群落可以比较好的重现自然群落的组成与结构。

叶/根特异OTU重组竞争形成组织特异的群落

Extended Data Figure 10 | 不同接种方式下形成群落结构表明器官形成特异的群落结构。结果表明根、叶中存在大部分相似的细菌种类，但还是存在明显特异的细菌和特异的群落结构。

Clay中接种根和土分离菌后群落结构

Supplementary Figure 2 | 热图展示无菌植物接种根和土分离菌后，在土、根和叶中形成群落中各成分的丰度分布。a/b为不同的起始接种菌比例。

结论：不同接种起始浓度对结果影响不大，会自发形成一定形态的群落结果。

叶片喷施叶来源菌后的群落结构

Supplementary Figure 3 | 热图展示无菌植物喷施接种叶片分离菌后，在根和叶中形成群落中各成分的丰度分布。a/b为不同的起始接种菌比例。

Clay中接种根、叶和土分离菌后群落结构

Supplementary Figure 4 | 热图展示无菌植物Clay中接种根、叶和土分离菌后，在土、根和叶中形成群落中各成分的丰度。

叶分离菌接种Clay后群落结构

Supplementary Figure 5 | 热图展示无菌植物叶分离菌接种于Clay，在根和叶中形成群落中各成分的丰度分布。a/b为不同的起始接种菌比例。

比较自然群体和人工重组群落不同接种方式下形成的群落结构

Supplementary Figure 6 | 箱线图展示自然群体、Clay+喷接种、Caly接种后形成的群落结构

结论：不同接种方式，对最后群落结构还是存在一定影响，存在一些显著差异的种类，如Chryseobacterium, Sphingomonas and Variovorax

Clay+喷所有菌后群落结构

Supplementary Figure 7 | 热图展示无菌植物分离菌接种于Clay，并于15天时喷L片来源菌，在根和叶中形成群落中各成分的丰度分布。a/b为不同的起始接种菌比例。

Clay只接根来源菌后群落结构

Supplementary Figure 8 | 热图展示无菌植物只接种根分离菌接种于Clay，在Clay、根和叶中形成群落中各成分的丰度分布。

根来源菌喷施后群落结构

Supplementary Figure 9 | 热图展示无菌植物只喷施接种根分离菌，在Clay、根和叶中形成群落中各成分的丰度分布。

写在后面

由于文章内容过多，我理解能力和讲解也有限。有相关研究的，大家要仔细看原文，研究实验设计，更清楚如何应用在自己的实验。

更多人工重组方面的研究，推荐阅读Dangle近期的Nature文章《Root microbiota drive direct integration of phosphate stress and immunity》。