SCIENCE：A GABAergic projection from the zona incerta to cortex promotes cortical neuron development

从未定带到皮层的GABA能神经元投射能促进皮层神经元的发育

 

γ-氨基丁酸(GABA)是成熟大脑中最主要的抑制性递质，但同时也是皮层发育中的兴奋物质。我们发现老鼠未定带(ZI)投射神经元在1皮质层形成一种GABA能轴突神经丛，使得神经元突触形成了深浅两个层次。类似的去极化GABA能神经丛也存在于发育期人脑皮层中。在小鼠出生前选择性沉默GABA能神经元，可减少其突触活动，且降低其皮层神经元顶端树状突起的复杂度。在未定带中的GABA能投射随着成熟会转变为抑制性神经元，可以用于阻断成人脑中的癫痫活动。这些数据揭示了从未定带到1皮质层早期发育的GABA能投射，这对于皮层神经元的正常发展和用抑制递质来平衡成人大脑皮层中的兴奋物质是不可或缺的。 

在胚胎发育过程中,神经活动(1、2)影响扩散,迁移, 和分化,以及环路细化(3 - 5)。在不成熟的大脑　由于高胞内氯神经递质GABA有兴奋作用　(6、7),相反在成人的大脑起抑制效应。GABA在不成熟的大脑皮层中来自所在区的中间神经元和其他脑区的轴突投射(8 - 12)。新生啮齿动物的大脑皮质层1有广泛的兴奋性gaba能投射(13、14)。在这里,我们表明,该未定带(ZI)生成gaba能丛的神经元。

我们对转基因小鼠未定带通路是通过操纵新生儿老鼠(产后一天P0-P1)大的名为紫红质通道蛋白(ChR2)在生长抑素(SST)表达神经元的表达(15、16)。标签被限制为ZIgaba能(图1),SST+(图1 c) 神经元病毒注射一周后,我们观察到EYFP +ZI　轴突投射躯体感觉和运动皮层的第1层中广泛分布(图1,A和B, 和图S1)。在P7,ChR2被ZI神经元可靠地表达,蓝光刺激诱导EYFP +ZI神经元(图1 D F)。我们用神经生物素填充躯体感觉和运动皮层的急性切片的第五层与皮质神经元急性片躯体感觉和运动皮层和免疫组化染色皮质层5  Ctip2标志(图1,16/16神经元)。这些锥体神经元的树突联系层1 EYFP +轴突的顶端突触(图1 g)和与同　gaba 能突触前标记vGat共处(GABA递质小泡)(图1 h)。

图层1的蓝光刺激诱发在第四层和第五层锥体神经元的突触反应。　光诱发反应分别的对a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole丙酸(AMPA)或n -甲基- d(NMDA)受体拮抗剂(6-cyano-2 3-dihydroxy-7-nitro-quinoxaline(CNQX)和D-2-amino-5 - phosphonovalerate(D-APV)不敏感。但是对GABAA受体拮抗剂的荷包牡丹碱(BMI)(图1 J L)所失效和　被河豚毒素(TTX,n = 4,图1 k)可逆屏蔽。刺激层1轴突也从2/3层神经元诱发GABA能反应,支持层1 gaba 能丛连接多层中锥体神经元的对新生儿小鼠的观察(13)。

从形态学来看，早在妊娠12周人类的大脑在皮质层1已经具有丰富gaba能突触(GW)(17、18)。在怀孕中期,底板神经元表现自发的发放和突触活动(19、20)。检查在人类大脑皮层GW 24中gaba能轴突的表达和分布,我们发现轴neurofilament-2H3和标志gaba能突触前vGat标志在皮质层1表达(图2,A到C)。GW 22的急性脑片发现，深皮质层锥体神经元有很高的膜电阻(1.1±0.1 gigaohms,n = 15),低的膜电容(23.0±2.9 pF,n = 15),和只发放一个或两个动作电位(图2 D 和E)(19)。大脑皮层神经元表达GABAA 受体(图S2)并显示典型的GABA能微型突触电流(图2)。因此,人类在后两个月大脑皮层神经元表达功能性GABAA受体。

我们通过神经生物素和使用后免疫标记链霉亲和素- 549和深层皮质层Ctip2标志记录皮层神经元的细胞的形态和位置特征。Ctip2标记表达式(图2 d 和图S3)确定第五层锥体神经的树突顶端一直延伸到大脑皮层第一层(图2 d)。我们只有当刺激层1才记录的健壮的诱发突触反应（图2 g),但深皮质层没有(-0.1±0.6 pA,n = 10)和底板(-1.6±0.5 pA,n = 10)。AMPA诱发反应对受体拮抗剂CNQX不敏感但被BMI屏蔽了(图2 G和H)。诱发突触电流流逆转-34.7 mV,接近Cl离子平衡电势[-31.1 mV = -46.0 mV 能斯特方程)+ 14.9 mV(接界电位), 通过GABAA受体调节　(图2,I和J)。

人类第一层皮质神经元gaba在GW20有反应，但在GW16或18能没有明显的反应。在GW22,多数的深层神经元表现gaba能突触反应。我们没有检测到GW 24层2/3神经元诱发反应,它仍然很不成熟(图。S4)。评估　层1gaba 能神经元对锥体神经元的反应潜在的贡献,我们对层1使用谷氨酸。虽然这诱导第一层神经元健壮的发放,它没有唤起层4层5锥体神经元突触反应(图S5)。因此,gaba能轴突神经丛源于层1在中期妊娠皮质的长距离投射神经元。

在老鼠大脑在出生后第一周GABA反应表现为去极化　(图S6)是由于胞内氯离子浓度高的结果[Cl -](6、7)。为了研究GW22皮质神经元GABA反应,我们使用短杆菌肽穿孔记录补丁以避免干扰细胞内(Cl -]。GABA反应逆转在-44.4 mV(图S7)和去极化，这是因为这个阶段皮层神经元的静止膜电位 -64.8±1.6 mv(n = 14)。然后通过加载一个膜渗透GABA神经元Oregon Green BAPTA-1AM，我们监测细胞内钙离子对GABA的反应。在第5层皮质神经元当地GABA使用诱导健壮的细胞内Ca2 +水平(图七)。因此,和老鼠一样(21-23),功能性GABA能突触首先被建立后，GABA在人类胎儿皮层表去极化。

为了探索在皮层发展中层1GABA能轴突神经丛的效果,我们选择阻止老鼠ZI区突触GABA释放，通过选择性表达的破伤风毒素轻链(TeLC)阻止突触囊泡释放(24)。在P0-P1,我们注入AAV病毒包含Cre-dependent TeLC融合2 a - 绿色荧光蛋白在人类的伸长因子1(EF1a)启动子(AAV1-EF1a-DIO-TeLC - 2a-gfp)立体定位到ZI区的SST::Cre;Ai14 小鼠。我们在一周内检测到GFP表达子(图S8)。测试TeLC的block效率，,我们首先同时注射 AAV1-DIO-ChR2和AAV1-DIO-TeLC-2A-GFP单方面到ZI。病毒注入一周后的急性脑片试验中蓝光刺激皮层1无法诱导层5锥体神经元突触电流(0.12±0.20 pA,n = 16;图3 A和B)。为了评估层1GABA能突触释放被ZI区TeLC表达损害的程度,我们记录由一层电刺激诱发的五层GAB能锥体神经元的反应。我们发现TeLC注射部位神经元侧诱发GABA能幅度响应减少了79.5%(34.1±1.8 pA,n = 18)与对侧大脑半球相比(166.0±6.4 pA,n = 13, P <0.001;Fig.3C)。给了TeLC-2A-GFP标记子SST +神经元的70.7%(n = 1465/2072;图S8), 　　这些数据表明,ZI区产后第一周预测提供输入层1的主要GABA能突触。

我们下一个检查了单侧AAV1-DIO-TeLC-2A-GFP注入P0-P1 SST:Cre小鼠ZI区GABA能神经元的运输皮层神经元的发展。注射后1周GABA能谷氨酸能突触电流自发的频率降低(图3 d 和图S9),但振幅保持不变(图S9)。TeLC注入同侧第5层神经元顶树突簇树突分支的数量减少。基底树突分支没有受到影响(图3,E到H)。我们还观察到TeLC处理后顶端突触树突脊数目减少(图3,I和J)。因此,第一层gaba ergic突触活动对锥体神经元突触和树突的正常发展是至关重要的。

　 由于更低的细胞内氯离子浓度，GABA在小鼠出生第一周后反应为超极化(图S6),然后成为抑制(7，25-27)。为了探索为何功能性ZI区GABA能通路仍然在成熟老鼠脑中存在我们使用的选择性标记ChR2层1子轴突P21小鼠(图4),发现蓝色光刺激诱导强劲锥体神经元的GABA能突触电流(图4 B和C)。为了评估皮层环路功能中ZI区GABA能投射的角色,我们使用一个片模型，Mg2 +无人工脑脊液使皮层兴奋增强(28)。然后我们使用细胞上记录保护细胞内Cl -完整性的第4层神经元。电刺激相同层数的相邻区域诱导记录神经元癫痫样的活动(图S10)。蓝光刺激共激活ZI轴突刺激层1 ChR2-表达轴突可逆地抑制诱导癫痫活动(图4, D和E),但对对侧半球缺乏ChR2表达的切片没有影响(图4 f和图S10)。因此,ZI区GABA能投射在成熟老鼠大脑中是抑制性的。

这次确定的环路是皮层的发展中最早出现的环路之一。而皮层中间神经元对环路功能的重要性已经有详细记载 (29、30),我们的研究显示ZI区环路起源于皮层神经元中间脑支持突触发生,顶端不是基底树突分支(图3,E H), 和脊柱发育(图3,我和J)。没有ZI区活动,我们发现在上层或下层神经元中抑制性突触后电流(IPSC)频率减少。

频率在上层和下层神经元;我们发现兴奋性突触后电流(EPSC)频率只在5层神经元减少(图3, E到H,和图S11),可能是因为它们接受不同的突触前输入，树突域目标不同(31)。GABA信号提升[Ca2 +](32),这可能是限制的顶树突簇(33)和可能调节顶树突簇发展。eelin和semaphorin 3A等神经营养因子用取决于活动的方式调节顶端树突分支和树突脊密度(34、35);因此,检查是否ZI区活动发展效应由神经营养因子调节将会很有趣(4、36、37)。相对温和的结构或大脑皮层神经元功能变化可能有实质性的行为学的影响。树突分枝,树突脊密度和大脑皮层神经元的突触活动的缺陷，这些由ZI区失活类似于多种神经发育疾病(9、38-41); 因此,ZI区通路可能在疾病病因中发挥作用(42)。