扩增子分析QIIME2. 3粪便菌群移植FMT分析实战
来源:互联网 发布:阿里云市值 编辑:程序博客网 时间:2024/04/29 03:12
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本人只习惯使用命令行模式分析数据,图形界面和Ipython模式下使用暂不介绍。本系列的教程主要以命令行方式为大家演示。在其它方面有使用的经验的朋友,欢迎共享您的使用笔记于“宏基因组”公众号,方便大家学习和使用。
扩增子分析QIIME2. 3粪便菌群移植分析
原文地址: https://docs.qiime2.org/2017.6/tutorials/fmt/
此实例需要一些基础知识,要求完成本系列文章前两篇内容:1简介和安装和2分析实战Moving Pictures。
本实验研究自闭症且胃肠道功能紊乱患者,采用粪便菌群移植方法,来降低患者的行为异常和肠道紊乱。监测移植后18个月范围内肠道菌群的变化,采用MiSeq PE300测序技术。
实验数据下载
# 激活工作环境source activate qiime2-2017.6# 创建工作目录并下载实验设计mkdir qiime2-fmt-tutorialcd qiime2-fmt-tutorialwget -O "sample-metadata.tsv" "https://data.qiime2.org/2017.6/tutorials/fmt/sample_metadata.tsv"# 下载成功跳过此步,下载失败处理方法:因为中国大陆用户没没有访问google的权限,请删除空文件,并下载备用链接rm sample-metadata.tsvwget http://bailab.genetics.ac.cn/markdown/QIIME2/sample-metadata.tsv# 下载实验数据,为演示分析,只使用原始数据10%的抽样结果,如果下载失败请重试即可。wget -O "fmt-tutorial-demux-1.qza" "https://data.qiime2.org/2017.6/tutorials/fmt/fmt-tutorial-demux-1-10p.qza"wget -O "fmt-tutorial-demux-2.qza" "https://data.qiime2.org/2017.6/tutorials/fmt/fmt-tutorial-demux-2-10p.qza"
序列质控评估
# 序列质量评估qiime demux summarize \ --i-data fmt-tutorial-demux-1.qza \ --o-visualization demux-summary-1.qzvqiime demux summarize \ --i-data fmt-tutorial-demux-2.qza \ --o-visualization demux-summary-2.qzv# 查看质量评估结果,用于确定下步质控的参数qiime tools view demux-summary-1.qzvqiime tools view demux-summary-2.qzv
查看可视化评估结果,也可下载qzv文件,使用 view.qiime2.org 打开查看,或直接打开作者在线预计算好的结果。 https://view.qiime2.org/?src=https%3A%2F%2Fdocs.qiime2.org%2F2017.6%2Fdata%2Ftutorials%2Ffmt%2Fdemux-summary-1.qzv
问题:从上图中我们判断选择质控的参数是什么?
序列上游13 bp的序列质量偏低,设置trim-left 13截掉前13bp序列;整体150bp的质量都不错,则保留150 bp的序列长度。
Feature表和代表性序列生成
# dada2去质控和去冗余,本实验有两批独立的数据,需要处理两次,生成代表序列和OTU表qiime dada2 denoise-single \ --p-trim-left 13 \ --p-trunc-len 150 \ --i-demultiplexed-seqs fmt-tutorial-demux-1.qza \ --o-representative-sequences rep-seqs-1.qza \ --o-table table-1.qzaqiime dada2 denoise-single \ --p-trim-left 13 \ --p-trunc-len 150 \ --i-demultiplexed-seqs fmt-tutorial-demux-2.qza \ --o-representative-sequences rep-seqs-2.qza \ --o-table table-2.qza
合并不同组的序列和表
# 合并两组数据和OTU表qiime feature-table merge \ --i-table1 table-1.qza \ --i-table2 table-2.qza \ --o-merged-table table.qza# 合并两组数据的代表性序列qiime feature-table merge-seq-data \ --i-data1 rep-seqs-1.qza \ --i-data2 rep-seqs-2.qza \ --o-merged-data rep-seqs.qza# OTU表统计qiime feature-table summarize \ --i-table table.qza \ --o-visualization table.qzv \ --m-sample-metadata-file sample-metadata.tsv# 查看Feature/OTU表的统计结果qiime tools view table.qzv# 代表性序列统计qiime feature-table tabulate-seqs \ --i-data rep-seqs.qza \ --o-visualization rep-seqs.qzv# 查看代表性序列的统计结果qiime tools view rep-seqs.qzv
table.qzv文件中Feature/OTU表统计的结果如下,或在线查看详细信息:https://view.qiime2.org/visualization/?type=html&src=https%3A%2F%2Fdocs.qiime2.org%2F2017.6%2Fdata%2Ftutorials%2Ffmt%2Ftable.qzv
OTU表总结
样品数据量分布
特征表频率统计
通过上表,我们可以确定Feature特征表标准化的重抽样数据,由于本测试,只用了文章原始数据的10%的数据,数据量很小,最小值为84,第一分位数为276,我们可选择276保留75%以上的样品。一般最小值最少1000,推荐5000以上。
多样性分析
现在我们已经获得了特征表(Feature/OTU),以及代表性序列(Feature Seq)
自己尝试用上篇文章的分析方法,回答下面这些问题。
前两节课的知识应该可以回答下面的问题,过两天我也会分析并做出答案。大家一定要实操才有真正分析的能力,想不出来就多操作和思路上一篇分析。
- 个人微生物组;
- 按subject-id分类存在组成差异?
- 按subject-id分类存在丰富度差异?
- 按subject-id分类存在均匀度差异?
- 菌群移植;
- 移植几周后,患者的菌群在unweighted unifrac距离下最像供体;
- 移植几周后,患者的菌群在bray-curtis距离下最像供体;
- 比较两种距离结果那种解释更好;
- 实验设计:比较粪便和试子样品采集方法
- 比较不同取样方法结果中最大差别的类别?差异类别用blast,或classifier注释有什么不同?
- 两类样品的unweighted unifrac和bray-curtis间有什么不同?
- 供体粪便与那种取样的结果更像?
- 两类取样方法的Alpha多样性存在差别吗?
- 每个测序Run中有多少样品?在不同测序Run中是否存在系统性差异?
Reference
- https://docs.qiime2.org/2017.6/tutorials/fmt/
- The data in this tutorial was initially presented in: Microbiota Transfer Therapy alters gut ecosystem and improves gastrointestinal and autism symptoms: an open-label study. Dae-Wook Kang, James B. Adams, Ann C. Gregory, Thomas Borody, Lauren Chittick, Alessio Fasano, Alexander Khoruts, Elizabeth Geis, Juan Maldonado, Sharon McDonough-Means, Elena L. Pollard, Simon Roux, Michael J. Sadowsky, Karen Schwarzberg Lipson, Matthew B. Sullivan, J. Gregory Caporaso and Rosa Krajmalnik-Brown. Microbiome (2017) 5:10. DOI: 10.1186/s40168-016-0225-7.
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