phrap 拼接序列

phrap是phred\phrap软件包的一部分，主要用于shotgun序列的组装。


主要特征:


允许使用全长的序列（而不仅仅是高质量部分）


使用质量信息进行组装提高组装的准确度


由最高质量部分的序列构建contig序列


提供广泛的组装信息帮助解决错拼等问题（包括contig序列的质量信息）


能够处理比较大的数据集




使用


程序运行命令行：


phrap [sequence file] –new_ace > phrap.out


输入


Fasta格式的核酸序列，如：pp.seq.screen：


>10_A8-9.ab1


gtgctctggtctctgctcctttcccctaagcaatagtaggcagaatcaac


aaaaacaaccccttctcccctccctacctggggaacagagccaatgagac


aggctcaggaacagggcaccagcacctgcactcaccattcaatctcttta


ggctcacggtccttcagaagctcttgtacctcctgccgacagcgctcctg


gtattccgggtgctttgcaaggtggtacaggacccaggagagaccactgg


cccccataaaaagtcacagtacctctgagggctcttgagtctaatctgag


acagtctctgaagattcatcctctttccagaaacccaagcccatcttgct


ctcctagaaacctttctataaaaaaaaaaaaan


>11_A8-9_R.ab1


gggagaggcggagctctggtccttgtcatctaagctgtgtggattgatcg


cctagaacctccctatctaccctccctacctggggaacagagccaatgag


aaaggctcaggaacagggcaccagcacctgcactcaccattcaatctctt


taggctcacggtccttcagaagctcttgtacctcctgccgacagcgctcc


caacttcttcccatcttcatcctggagagaaggcaataaccccccacccc


cacccccataaaaagtcacagtacctctgagggctcttgagtctaatctg


agacagtctctgaagattcatcctctttccagaaacccaagcccatcttg


ctctccagaacccttcttaaa


>15_A8-9.ab1


aagactggcagnggatctctgcatctagtcacctaagctatagctggtag


actcgaccaaaacaaccctttctaccctccctacctggggaacagagcca


atgagacaggctcaggaacag


… …


如有质量文件，则质量文件需和序列文件放在同一目录下，且名字为[序列文件名.qual]，如，序列文件名为pp.seq.screen，质量文件名必须为pp.seq.screen.qual，质量文件不需要在命令行中。并且质量文件中的序列和序列文件中的序列必须一一对应，包括顺序和碱基个数。


输出


在程序运行目录，除屏幕输出外，会产生一系列相关文件，分别为：


*.contigs文件。组装好的contig序列，格式为FASTA格式。其中包括单个read的contig（这类reads和其他contig有比对上的部分，但达不到连上的标准）。


*.contigs.qual文件。Contig组装的质量文件，FASTA格式。此文件记录每个contig的碱基质量信息。


*.singlets 文件。和任何其他reads没有overlap的序列，FASTA格式。


*.log文件和*.problems文件。对使用者基本没用。


*.ace 文件。当使用参数-new_ace或-old_ace时才会产生的文件，用consed查看组装结果时需要。


*.view 文件。当使用-view参数时产生的文件，用phrapview查看组装结果时需要。


除以上文件外，phrap还有屏幕输出，可重定向到文件，如phrap > phrap.out，此输出包含contigs的组成信息。




参数


详细的参数列表可以查看phrap文档：


参数及默认值：


1. 比对分值


-penalty -2    碱基不匹配（替换）罚分


-gap_init penalty-2    gap罚分


-gap_ext penalty-1    扩展gap罚分


-ins_gap_ext gap_ext    插入罚分


-del_gap_ext gap_ext    删除罚分


-matrix [None]    打分矩阵


-raw *    只用原始的Smith-Waterman打分


2. 结合搜索


-minmatch 14    最小匹配长度


-maxmatch 30    最大匹配长度，默认为30


-max_group_size 20    组的限制


-word_raw *    Use raw rather than complexity-adjusted word length, in testing against minmatch (N.B. maxmatch always refer to raw lengths).


-bandwidth 14    1/2 band width for banded SWAT searches (full width is 2 times bandwidth + 1).


3. 比对过滤参数


-minscore 30    最小比对分值


-vector_bound 80    序列开始部分可能的载体碱基数目


Special cases:


-masklevel 0    只报告单条最高分值的比对


-masklevel 100    report any match whose domain is not completely contained within a higher scoring match


-masklevel 101    报告所有的比对


4. 输入相关


-default_qual 15    没有质量文件时的碱基默认质量值


-subclone_delim .    克隆名称的分隔符号


-n_delim 1    Indicates which occurrence of the subclone delimiter character denotes the end of the subclone name


-group_delim _     Group name delimiter: Character used to indicate end of that part of the read name that corresponds to the group name (relevant only if option -preassemble is used);


-trim_start 0    序列开头去掉的碱基数


5. 组装相关


-forcelevel 0    Relaxes stringency to varying degree during final contig merge pass.


-bypasslevel 1    Controls treatment of inconsistent reads in merge.


-maxgap 30    Maximum permitted size of an unmatched region in merging contigs, during first (most stringent) merging pass.


-repeat_stringency .95    控制匹配的严紧度


-revise_greedy *    在弱结合部位打断，并尝试重新结合


-shatter_greedy *    打断弱的结合但不尝试重新结合


-preassemble *    组内序列先结合


-force_high *    Causes edited high-quality discrepancies to be ignored during final contig merge pass.


6. 一致性序列构建参数


-node_seg 8    Minimum segment size (for purposes of traversing weighted directed graph).


-node_space 4    Spacing between nodes (in weighted directed graph).


7. 输出相关


-tags *    Tag selected lines in the standard output, to facilitate parsing.


-screen *    when the -old_ace or -new_ace option is specified (see below), this option causes parts of the read sequences that consist of phrap-inferred sequencing vector and chimeric segments to be replaced by X's in the .ace file.


-old_ace *    产生旧格式的ace文件


-new_ace *    产生新格式的ace文件


-ace *    同参数-new_ace


-view *    产生适用于phrapview的".view"文件


-qual_show 20    Cutoff for flagging "low_quality" regions in contig sequence and "high quality" discrepancies between read and contig.


-print_extraneous_matches *    打印contigs间的非局部比对信息


8. 其他


-retain_duplicates *    保留完全相同的序列，而不是去除


-max_subclone_size 5000    最大克隆长度


-trim_penalty -2    Penalty used for identifying degenerate sequence at beginning & end of read.


-trim_score 20    Minimum score for identifying degenerate sequence at beginning & end of read.


-trim_qual 13    定义序列高质量部分的质量值


-confirm_length 8    Minimum size of confirming segment.


-confirm_trim 1    Amount by which confirming segments are trimmed at edges.


-confirm_penalty -5    Penalty used in aligning against "confirming" reads.


-confirm_score 30    Minimum alignment score for a read to be allowed to "confirm" part of another read.


-indexwordsize 10    Size of indexing (hashing) words, used in finding word matches between sequences.


 


运行问题


内存不足：


如果程序运行提前终止，并给出以下错误信息提示：


FATAL ERROR: REQUESTED MEMORY UNAVAILABLE


程序长时间运行：


可以试着提高参数-minmatch的值


phrap 注意事项


 


数据量和数据性质


通常情况下reads数量不要超过15万。


如果覆盖度不是很高并且重复序列很少，phrap能完成50万以下的拼接。


如果覆盖度很高（几十以上）或者重复序列很多，phrap就很难处理了。对于特殊数据的拼接策略


对于有重复序列的非finish项目，可以通过对序列的深度统计去掉高重复的reads，只保留uniq区的reads拼接(RePS方法)。


同样在比较难拼接的finish项目中也可以使用这种策略来保证正确性，再通过其他方法补充gap


 


phrap.out文件包含了reads拼成contig的方式，包括位置，方向等。把这些信息提取出来存入contig.list文件