发酵工程导论

学习指导

    发酵工程是利用微生物的生命活动来制备微生物菌体，生产微生物代谢产物或实现物质转化的工程技术。掌握工业发酵生产常用微生物的形态，生物特点是学习的基础，掌握微生物菌种的筛选、培养基的配制、菌种的扩大培养、发酵操作方式及工艺条件的控制是学习的重点。认识发酵基本过程及常用的发酵设备。了解典型发酵产品的生产工艺。

 

内容简介

    发酵工程是生物技术的重要组成部分，是生物技术产业化的重要环节。它将微生物学、生物化学和化学工程学的基本原理有机地结合起来，是一门利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术。由于它以培养微生物为主，所以又称微生物工程。生物化学上定义发酵为“微生物在无氧时的代谢过程”。目前，人们把利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体或其代谢产物的程统称为发酵。早在几千年前，人们就开始从事酿酒。制酱、制奶酪等生产。作为现代科学概念的微生物发酵工业，是在40年代随着抗生素工业的兴起而得到迅速发展的。
    发酵是指利用微生物制造工业原料或工业产品的过程。根据各种微生物的特性，在有氧或无氧条件下利用生物催化(酶)的作用，将多种低值原料转化成不同的产品的过程。如酿酒、制酱和醋等发酵技术古已有之。

 

微生物发酵过程

    微生物发酵过程即微生物反应过程，是指由微生物在生长繁殖过程中所引起的生化反应过程。
    根据微生物的种类不同（好氧、厌氧、兼性厌氧），可以分为好氧性发酵和厌氧性发酵两大类。
（1）好氧性发酵 在发酵过程中需要不断地通人一定量的无菌空气，如利用黑曲霉进行柠檬酸发酵、利用棒状杆菌进行谷氨酸发酵、利用黄单抱菌进行多糖发酵等等。
（2）厌氧性发酵 在发酵时不需要供给空气，如乳酸杆菌引起的乳酸发酵、梭状芽抱杆菌引起的丙酮、丁醇发酵等。
（3）兼性发酵 酵母菌是兼性厌氧微生物，它在缺氧条件下进行厌气性发酵积累酒精，而在有氧即通气条件下则进行好氧性发酵，大量繁殖菌体细胞。 
    按照设备来分，发酵又可分为敞口发酵、密闭发酵、浅盘发酵和深层发酵。
一般敞口发酵应用于繁殖快并进行好氧发酵的类型，如酵母生产，由于其菌体迅速而大量繁殖，可抑制其他杂菌生长。所以敞口发酵设备要求简单。相反，密闭发酵是在密闭的设备内进行，所以设备要求严格，工艺也较复杂。浅盘发酵（表面培养法）是利用浅盘仅装一薄层培养液，接人菌种后进行表面培养，在液体上面形成一层菌膜。在缺乏通气设备时，对一些繁殖快的好氧性微生物可利用此法。深层发酵法是指在液体培养基内部（不仅仅在表面）进行的微生物培养过程。 
    液体深层发酵是在青霉素等抗生素的生产中发展起来的技术。同其他发酵方法相比，它具有很多优点：
①液体悬浮状态是很多微生物的最适生长环境。
②在液体中，菌体及营养物、产物（包括热量）易于扩散，使发酵可在均质或拟均质条件下进行，便于控制，易于扩大生产规模。
③液体输送方便，易于机械化操作。
④厂房面积小，生产效率高，易进行自动化控制，产品质量稳定。
⑤产品易于提取、精制等。因而液体深层发酵在发酵工业中被广泛应用。

工业生产常用微生物

    微生物资源非常丰富，广布于土壤、水和空气中，尤以土壤中为最多。有的微生物从自然界中分离出来就能够被利用，有的需要对分离到的野生菌株进行人工诱变，得到突变株才能被利用。当前发酵工业所用菌种的总趋势是从野生菌转向变异菌，从自然选育转向代谢控制育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。工业生产上常用的微生物主要是细菌、放线菌、酵母菌和霉菌，由于发酵工程本身的发展以及遗传工程的介人，藻类、病毒等也正在逐步地变为工业生产用的微生物。其他微生物有担子菌、 藻类。

培养基

培养基的种类

    培养基是人们提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物需要的多种营养物质的混合物。培养基的成分和配比，对微生物的生长、发育、代谢及产物积累，甚至对发酵工业的生产工艺都有很大的影响。依据其在生产中的用途，可将培养基分成抱子
培养基、种子培养基和发酵培养基等。
（1）抱子培养基抱于培养基是供制备泡子用的。
（2）种于培养基 种子培养基是供抱子发芽和菌体生长繁殖用的。
（3）发酵培养基 发酵培养基是供菌体生长繁殖和合成大量代谢产物用的。

发酵培养基的组成
　　发酵培养基的组成和配比由于菌种不同，设备和工艺不同以及原料来源和质量不同而有所差别。因此，需要根据不同要求考虑所用培养基的成分与配比。但是综合所用培养基的营养成分，不外乎是碳源（包括用作消泡剂的油类）、氮源、无机盐类（包括微量元素）、生长因子、水、产物形成的诱导物、前体和促进剂等几类。

 

发酵的一般过程
    生物发酵工艺多种多样，但基本上包括菌种制备、种子培养、发酵和提取精制等下游处理几个过程。典型的发酵过程如图所示。以下以霉菌发酵为例加以说明。

菌种
    在进行发酵生产之前，首先必须从自然界分离得到能产生所需产物的菌种，并经分离、纯化及选育后或是经基因工程改造后的"工程菌"．才能供给发酵使用。为了能保持和获得稳定的高产菌株，还需要定期进行菌种纯化和育种，筛选出高产量和高质录的优良菌株。

 

种子扩大培养
    种子扩大培养是指将保存在砂上管，冷冻干燥管或冰箱中处于休眠状态的生产菌种，接入试管斜面活化后，再经过茄子瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程。这些纯种培养物称为种子。 
    发酵产物的产量与成品的质量，与菌种性能以及抱于和种子的制备情况密切相关。先将贮存的菌种进行生长繁殖，以获得良好的抱子，再用所得的抱子制备足够量的菌丝体，供发酵罐发酵使用。种子制备有不同的方式，有的从摇瓶培养开始，将所得摇瓶种子液接入到种子罐进行逐级扩大培养，称为菌丝进罐培养；有的将泡了百接接入种子罐进行扩大培养，称为抱子进罐培养。采用哪种方式和多少培养级数，取决于菌种的性质。生产规模的大小和生产工艺的特点，种子制备一般使用种子罐，扩大培养级数通常为二级。种厂制备的工艺流程如图4－2所示示。对于不产孢子的菌种，经试管培养直接得到菌体，再经摇瓶培养后即可作为种子罐种子。 

 

发酵
    发酵是微生物合成大量产物的过程，是整个发酵工程的中心环节。它是在无菌状态下进行纯种培养的过程。因此，所用的培养基和培养设备都必须经过灭菌，通入的空气或中途的补料都是无菌的，转移种子也要采用无菌接种技术。通常利用饱和蒸汽对培养基进行灭菌，灭菌条件是在120℃（约0.1MPa表压）维持20～30min。空气除菌则采用介质过滤的方法，可用定期灭菌的干燥介质来阻截流过的空气中所含的微生物，从而制得无菌空气。发酵罐内部的代谢变化（菌丝形态、菌浓、糖、氮含量、PH值，溶氧浓度和产物浓度等）是比较复杂的，特别是次级代谢产物发酵就更为复杂，它受许多因素控制。

 

下游处理
    发酵结束后，要对发酵液或生物细胞进行分离和提取精制，将发酵产物制成合乎要求的成品。

 

发酵的操作方式
    根据操作方式的不同，发酵过程主要有分批发酵、连续发酵和补料分批发酵三种类型。

 

分批发酵
    营养物和菌种一次加入进行培养，直到结束放出，中间除了空气进入和尾气排出，与外部没有物料交换。传统的生物产品发酵多用此过程，它除了控制温度和PH及通气以外，不进行任何其他控制，操作简单。但从细胞所处的环境来看，则明显改变，发酵初期营养物过多可能抑制微生物的生长，而发酵的中后期可能又因为营养物减少而降低培养效率，从细胞的增殖来说，初期细胞浓度低，增长慢，后期细胞浓度虽高，但营养物浓度过低也长不快，总的生产能力不是很高。 

分批发酵的具体操作如下                  

 

                             

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

    首先种子培养系统开始工作，即对种子罐用高压蒸汽进行空罐灭菌（空消），之后投入培养基再通高压蒸汽进行实罐灭菌（实消），然后接种，即接入用摇瓶等预先培养好的种子，进行培养。在种子罐开始培养的同时，以同样程序进行主培养罐的准备工作。对于大型发酵罐，一般不在罐内对培养基灭菌，而是利用专门的灭菌装置对培养基进行连续灭菌（连消）。种子培养达到一定菌体量时，即转移到主发酵罐中。发酵过程中要控制温度和PH，对于需氧微生物还要进行搅拌和通气。主罐发酵结束即将发酵液送往提取、精制工段进行后处理。 
    根据不同发酵类型，每批发酵需要十几个小时到几周时间。其全过程包括空罐灭菌、加入灭过菌的培养基、接种、培养的诱导期、发酵过程、放罐和洗罐，所需时间的总和为一个发酵周期。

    分批培养系统属于封闭系统，只能在一段有限的时间内维持微生物的增殖，微生物处在限制性条件下的生长，表现出典型的生长周期。
    培养基在接种后，在一段时间内细胞浓度的增加常不明显，这一阶段为延滞期，延滞期是细胞在新的培养环境中表现出来的一个适应阶段。接着是一个短暂的加速期，细胞开始大量繁殖，很快到达指数生长期。在指数生长期，由于培养基中的营养物质比较充足，有害代谢物很少，所以细胞的生长不受限制，细胞浓度随培养时间呈指数增长，也称对数生长期。随着细胞的大量繁殖，培养基中的营养物质迅速消耗，加上有害代谢物的积累，细胞的生长速率逐渐下降，进人减速期。因营养物质耗尽或有害物质的大量积累，使细胞浓度不再增大，这一阶段为静止期或稳定期。在静止期，细胞的浓度达到最大值。最后由于环境恶化，细胞开始死亡，活细胞浓度不断下降，这一阶段为衰亡期。大多数分批发酵在到达衰亡期前就结束了。迄今为止，分批培养是常用的培养方法，广泛用于多种发酵过程。

 

连续发酵
    所谓连续发酵，是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定，微生物在稳定状态下生长。稳定状态可以有效地延长分批培养中的对数期。在稳定的状态下，微生物所处的环境条件，如营养物浓度、产物浓度、PH值等都能保持恒定，微生物细胞的浓度及其比生长速率也可维持不变，甚至还可以根据需要来调节生长速度。
连续发酵使用的反应器可以是搅拌罐式反应器，也可以是管式反应器。在罐式反应器中，即使加入的物料中不含有菌体，只要反应器内含有一定量的菌体，在一定进料流量范围内，就可实现稳态操作。罐式连续发酵的设备与分批发酵设备无根本差别，一般可采用原有发酵罐改装。根据所用罐数，罐式连续发酵系统又可分单罐连续发酵和多罐连续发酵（如图所示）。

(单罐连续发酵)

(多罐连续发酵)

    如果在反应器中进行充分的搅拌，则培养液中各处的组成相同，且与流出液的组成一样，成为一个连续流动搅拌罐式反应器（CSTR）。连续发酵的控制方式有两种：一种为恒浊器（turbidostat）法，即利用浊度来检测细胞的浓度，通过自控仪表调节输入料液的流量，以控制培养液中的菌体浓度达到恒定值；另一种为恒化器（chemostat）它与前者的相似之处是维持一定的体积，不同之处是菌体浓度不是直接控制的，而是通过恒定输入的养料中某一种生长限制基质的浓度来控制。
    在管式反应器中，培养液通过一个返混程度较低的管状反应器向前流动（返混--反应器内停留时间不同的料液之间的混合），其理想型式为活塞流反应器（PFR，没有返混）。在反应器内沿流动方向的不同部位，营养物浓度。细胞浓度、传氧和生产率等都不相同。在反应器的人口，微生物细胞必须和营养液一起加到反应器内。通常在反应器的出口，装一支路使细胞返回，或者来自另一个连续培养罐。这种微生物反应器的运转存在许多困难，故目前主要用于理论研究，基本上还未进行实际应用。 

与分批发酵相比，连续发酵具有以下优点：
    ①可以维持稳定的操作条件，有利于微生物的生长代谢，从而使产率和产品质量也相应保持稳定；

    ②能够更有效地实现机械化和自动化，降低劳动强度，减少操作人员与病原微生物和毒性产物接触的机会；

    ③减少设备清洗。准备和灭菌等非生产占用时间，提高设备利用率，节省劳动力和工时；

    ④由于灭菌次数减少，使测量仪器探头的寿命得以延长；

    ⑤容易对过程进行优化，有效地提高发酵产率。

当然，它也存在一些缺点：
    ①由于是开放系统，加上发酵周期长，容易造成杂菌污染；

    ②在长周期连续发酵中，微生物容易发生变异；

    ③对设备、仪器及控制元器件的技术要求较高；

    ④粘性丝状菌菌体容易附着在器壁上生长和在发酵液内结团，给连续发酵操作带来困难。

    由于上述情况，连续发酵目前主要用于研究工作中，如发酵动力学参数的测定，过程条件的优化试验等等，而在工业生产中的应用还不多。连续培养方法可用于面包酵母和饲料酵母的生产，以及有机废水的活性污泥处理。另外，酒精连续发酵生产技术在前苏联也已获得成功的应用。而新近发展的一种培养方法则是把固定化细胞技术和连续培养方法结合起来，用于生产丙酮、丁醇、正丁醇、异丙醇等重要工业溶剂。 

 

 

补料分批发酵
    补料分批发酵又称半连续发酵，是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术，是指在微生物分批发酵中，以某种方式向培养系统补加一定物料的培养技术。通过向培养系统中补充物料，可以使培养液中的营养物浓度较长时间地保持在一定范围内，既保证微生物的生长需要，又不造成不利影响，从而达到提高产率的目的。

    补料在发酵过程中的应用，是发酵技术上一个划时代的进步。补料技术本身也由少次多量、少量多次，逐步改为流加，近年又实现了流加补料的微机控制。但是，发酵过程中的补料量或补料率，目前在生产中还只是凭经验确定，或者根据一、两个一次检测的静态参数（如基质残留量、PH、溶解氧浓度等）设定控制点，带有一定的盲目性，很难同步地满足微生物生长和产物合成的需要，也不可能完全避免基质的凋控反应。因而现在的研究重点在于如何实现补料的优化控制。 
    补料分批发酵可以分为两种类型：单一补料分批发酵和反复补料分批发酵。在开始时投入一定量的基础培养基，到发酵过程的适当时期，开始连续补加碳源或（和）氮源或（和）其他必需基质，直到发酵液体积达到发酵罐最大操作容积后，停止补料，最后将发酵液一次全部放出。这种操作方式称为单一补料分批发酵。该操作方式受发酵罐操作容积的限制，发酵周期只能控制在较短的范围内。反复补料分批发酵是在单一补料分批发酵的基础上，每隔一定时间按一定比例放出一部分发酵液，使发酵液体积始终不超过发酵罐的最大操作容积，从而在理论上可以延长发酵周期，直至发酵产率明显下降，才最终将发酵液全部放出。这种操作类型既保留了单一补料分批发酵的优点，又避免了它的缺点。补料分批发酵作为分批发酵向连续发酵的过渡，兼有两者之优点，而且克服了两者之缺点。同传统的分批发酵相比，它的优越性是明显的。首先它可以解除营养物基质的抑制，产物反馈抑制和葡萄糖分解阻遏效应（葡萄糖效应--葡萄糖被快速分解代谢所积累的产物在抑制所需产物合成的同时，也抑制其他一些碳源、氮源的分解利用）。

（补料在发酵过程中的应用）

    对于好氧发酵，它可以避免在分批发酵中因一次性投入糖过多造成细胞大量生长，耗氧过多，以至通风搅拌设备不能匹配的状况，还可以在某些情况下减少菌体生成量，提高有用产物的转化率 在真菌培养中，菌丝的减少可以降低发酵液的粘度，便于物料输送及后处理 与连续发酵相比，它不会产生菌种老化和变异问题，其适用范围也比连续发酵广。
    目前，运用补料分批发酵技术进行生产和研究的范围十分广泛，包括中细胞蛋白、氨基酸、生长激素、抗生素、维生素、酶制剂、有机溶剂、有机酸、核苷酸、高聚物等，几乎遍及整个发酵行业。它不仅被广泛用于液体发酵中，在固体发酵及混合培养中也有应用。随着研究工作的深入及微机在发酵过程自动控制中的应用，补料分批发酵技术将日益发挥出其巨大的优势。

 

 

发酵工艺控制　　 发酵过程中，为了能对生产过程进行必要的控制，需要对有关工艺参数进行定期取样测定或进行连续测量。有关的参数如表42所示。反映发酵过程变化的参数可以分为两类：一类是可以直接采用特定的传感器检测的参数。它们包括反映物理环境和化学环境变化的参数，如温度、压力、搅拌功率、转速、泡沫、发酵液粘度、浊度、PH、离子浓度、溶解氧、基质浓度等，称为直接参数。另一类是至今尚难于用传感器来检测的参数，包括细胞生长速率、产物合成速率和呼吸嫡等。这些参数需要根据一些直接检测出来的参数，借助于电脑计算和特定的数学模型才能得到。因此这类参数被称为间接参数。上述参数中，对发酵过程影响较大的有温度、PH、溶解氧浓度等。